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氣相液氮運輸罐短期儲存胚胎的可行性研究材料和方法（上）
時間:2019-05-21 13:32來源: 作者:班德液氮罐 點擊:
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1．1動物
B10A、C57BL／6、DBA／2、B6D2，均由中科院上海實驗動物中心提供。雄鼠為8周齡、雌鼠為4周齡。另外胚胎移植受體使用lO周ICR雌鼠【SCXK(滬)2007．o005】。實驗嚴(yán)格遵守SPF級標(biāo)準(zhǔn)要求[SYXK(滬)2007．0005】。自增壓液氮罐
1．2主要儀器
MⅦXC47／11一lO型液相液氮罐，MⅥZ SC4／3V型氣相液氮運輸罐，Heraeus C02培養(yǎng)箱，NikonSMZ．10實體顯微鏡等。
1．3培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
[氣相液氮運輸罐短期儲存胚胎的可行性研究材料和方法（上）]
體外受精液：HTF(表1)；胚胎冷凍液：DMsO(Si舀m D2650)DAP213(DMSO：A七etaITlide：P玎叩yleneglycol=2：1：3)；石蠟油：(Sigma M8410)。在體外授精前1 d，準(zhǔn)備好精子獲能和體外授精的培養(yǎng)液滴(200“1)，上面覆蓋經(jīng)胚胎測試過的石蠟油，放入37℃，5％Co：的培養(yǎng)箱里隔夜平衡。
1．4氣相液氮運輸罐的準(zhǔn)備在使用前1 d先將液氮沖入氣相液氮運輸罐到罐體的一半，放置5 h，降低罐內(nèi)溫度。然后再將液氮充滿，使液氮吸附劑充分吸附液氮，放置24 h后，將多余的液氮倒出后待用。
1．5體外授精
取4周齡的小鼠，在體外授精前3 d的20：oo，每只腹腔注射PMSG 5IU，48 h后，再每只腹腔注射hCG 5IU。注射hCG后約13 h處死小鼠，打開腹腔，迅速分離輸卵管，在濾紙上除去血跡后放入培養(yǎng)皿的石蠟油中，用解剖針挑破輸卵管膨大部，卵子自然流出，用解剖針將卵子團(tuán)引入到隔夜平衡的200 m H1F受精液滴中。在雌鼠注射hCG約12 h后用頸椎脫臼的方法處死雄鼠，打開腹腔，迅速分離附睪尾和輸精管，盡可能除去黏附在附睪尾的脂肪和血跡。用手指捏住附睪尾，用眼科剪在其上部切開，用解剖針挑取精子放入隔夜平衡的200 ulHTF受精液滴里，培養(yǎng)1～1．5 h。將培養(yǎng)l h的精子懸浮液在顯微鏡‘卜．觀察活力和數(shù)量后，每個受精液滴加入10 L‘l獲能的精子。第二天早上洗卵，對2．細(xì)胞的胚胎進(jìn)行計數(shù)。自增壓液氮罐
B10A、C57BL／6、DBA／2、B6D2，均由中科院上海實驗動物中心提供。雄鼠為8周齡、雌鼠為4周齡。另外胚胎移植受體使用lO周ICR雌鼠【SCXK(滬)2007．o005】。實驗嚴(yán)格遵守SPF級標(biāo)準(zhǔn)要求[SYXK(滬)2007．0005】。自增壓液氮罐
1．2主要儀器
MⅦXC47／11一lO型液相液氮罐，MⅥZ SC4／3V型氣相液氮運輸罐，Heraeus C02培養(yǎng)箱，NikonSMZ．10實體顯微鏡等。
1．3培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
[氣相液氮運輸罐短期儲存胚胎的可行性研究材料和方法（上）]
體外受精液：HTF(表1)；胚胎冷凍液：DMsO(Si舀m D2650)DAP213(DMSO：A七etaITlide：P玎叩yleneglycol=2：1：3)；石蠟油：(Sigma M8410)。在體外授精前1 d，準(zhǔn)備好精子獲能和體外授精的培養(yǎng)液滴(200“1)，上面覆蓋經(jīng)胚胎測試過的石蠟油，放入37℃，5％Co：的培養(yǎng)箱里隔夜平衡。
1．4氣相液氮運輸罐的準(zhǔn)備在使用前1 d先將液氮沖入氣相液氮運輸罐到罐體的一半，放置5 h，降低罐內(nèi)溫度。然后再將液氮充滿，使液氮吸附劑充分吸附液氮，放置24 h后，將多余的液氮倒出后待用。
1．5體外授精
取4周齡的小鼠，在體外授精前3 d的20：oo，每只腹腔注射PMSG 5IU，48 h后，再每只腹腔注射hCG 5IU。注射hCG后約13 h處死小鼠，打開腹腔，迅速分離輸卵管，在濾紙上除去血跡后放入培養(yǎng)皿的石蠟油中，用解剖針挑破輸卵管膨大部，卵子自然流出，用解剖針將卵子團(tuán)引入到隔夜平衡的200 m H1F受精液滴中。在雌鼠注射hCG約12 h后用頸椎脫臼的方法處死雄鼠，打開腹腔，迅速分離附睪尾和輸精管，盡可能除去黏附在附睪尾的脂肪和血跡。用手指捏住附睪尾，用眼科剪在其上部切開，用解剖針挑取精子放入隔夜平衡的200 ulHTF受精液滴里，培養(yǎng)1～1．5 h。將培養(yǎng)l h的精子懸浮液在顯微鏡‘卜．觀察活力和數(shù)量后，每個受精液滴加入10 L‘l獲能的精子。第二天早上洗卵，對2．細(xì)胞的胚胎進(jìn)行計數(shù)。自增壓液氮罐
