微生物菌種資源的長期有效保藏是微生物菌種資源有效實施共享的前提，采用操作性簡便、保藏周期長、遺傳變異率低是菌種資源保藏方法的選擇。液氮罐

1、范圍

本規(guī)程規(guī)定了冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術的定義、原理、技術要求、方法與步驟。

本規(guī)程適用于普通病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌及擔子菌等微生物菌種的保藏。

對于病原微生物及其他需要特殊操作技術的微生物的參見相應的技術規(guī)程。

2、規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本規(guī)范的引用而成為本規(guī)范的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本規(guī)范，然而，鼓勵根據(jù)本規(guī)范達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本規(guī)范。

國務院令第 424 號《病原微生物實驗室生物安全管理條例》

GB 19489  實驗室  生物安全通用要求

科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件  自然科技資源共性描述規(guī)范（試行）

3、術語和定義

下列術語和定義適用于本規(guī)范。

3.1

冷凍干燥  freeze-drying

將微生物冷凍，在減壓下利用升華作用除去水分，使細胞的生理活動趨于停止，從而長期維持存活狀態(tài)。

3.2液氮超低溫保藏  preservation  in  liquid  nitrogen

液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196℃的液態(tài)氮，或在-150℃的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。

3.3   -80℃低溫冷凍保藏  preservation  in  -80℃

將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細胞的生理活動進行冷凍的一種保藏方法。

4、內(nèi)容

4.1   微生物菌種的冷凍干燥保藏技術規(guī)程

4.1.1   好氧菌冷凍干燥管的制備

4.1.1.1   安瓿管準備

安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

4.1.1.2   保護劑的選擇和準備

保護劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。

4.1.1.3    凍干樣品的準備

在最適宜的培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進行純度檢查后（參見《微生物菌種純度檢測技術規(guī)程》），與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，最好在1-2小時內(nèi)分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。

4.1.1.4    預凍

一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。

4.1.1.5   冷凍干燥

采用冷凍干燥機進行冷凍干燥。

將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。

終止干燥時間應根據(jù)下列情況判斷：

——安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀

——真空度接近空載時的最高值

——樣品溫度與管外溫度接近

——選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結

——選用一個安瓿管，裝1-2%氯化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結

冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。

4.1.1.6   真空封口及真空檢驗

將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。

熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

4.1.1.7   保藏

安瓿管應低溫避光保藏。

4.1.1.8   質(zhì)量檢查

冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。

4.1.2    厭氧菌冷凍干燥管的制備

主要程序與需氧菌操作相同

4.1.2.1   安瓿管準備

參見4.1.1.1

4.1.2.2   保護劑的選擇和準備

保護劑使用前應在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護劑中的溶解氧 液氮罐

4.1.2.3    凍干樣品的準備

參見4.1.1.3

4.1.2.4   預凍

參見4.1.1.4

4.1.2.5冷凍干燥

參見4.1.1.5

4.1.2.6    真空封口及真空檢驗

參見4.1.1.6

4.1.2.7   保藏

參見4.1.1.7

4.1.2.8    質(zhì)量檢查

參見4.1.1.8

4.1.3    冷凍干燥法適用范圍

適用于大多數(shù)細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。

4.1.4    保藏周期

不同微生物復蘇周期不同，一般10年左右。

4.1.5   復蘇方法

——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，

——將安瓿管頂部燒熱，

——用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端，

——用無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進行適溫培養(yǎng)。

4.2     微生物菌種低溫冷凍保藏技術

4.2.1  液氮超低溫保藏技術

4.2.1.1   安瓿管或凍存管的準備

用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈，  121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

4.2.1.2   保護劑的準備

保護劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度，一般采用10-20% 甘油。

4.2.1.3    微生物保藏物的準備

微生物不同的生理狀態(tài)對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。

分裝時注意應在無菌條件下操作。

菌種的準備可采用下列幾種方法：

刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內(nèi)；

接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內(nèi)；

將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內(nèi)；

在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2-10天后，加入保護劑，待保藏。

4.2.1.4      預凍

預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。

目前常用的有三種控溫方法：

——程序控溫降溫法，應用電子計算機程序控制降溫裝置，可以穩(wěn)定連續(xù)降溫，能很好地控制降溫速率。

——分段降溫法：將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。

——對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。

4.2.1.5   保藏
 
將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。液氮罐

4.2.1.6保藏周期

一般10年以上。

4.2.1.7   復蘇方法

從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內(nèi)部結冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

4.2.1.8   適用范圍

各類微生物。

4.2.1.9   液氮保藏應注意事項

——防止凍傷，操作注意安全，帶面罩及皮手套

——塑料凍存管一定要擰緊螺帽

——運送液氮時一定要用專用特制的容器，絕不可用密閉容器存放或運輸液氮，切勿使用保溫瓶存放液氮

——注意存放液氮容器的室內(nèi)通風，防止過量氮氣使人窒息

——防止安瓿管或塑料凍存管破裂爆炸，如液氮滲入管內(nèi)，當從液氮容器取出時，液態(tài)氮體積膨脹約680倍，爆炸力很大，要特別小心

——注意觀察液氮容器中液氮的殘存量，定期補充液氮。

4.2.2    -80℃低溫冷凍保藏

4.2.2.1  安瓿管或凍存管的準備

參見4.2.1.1

4.2.2.2   保護劑的準備

參見4.2.1.2

4.2.2.3   微生物保藏物的準備

參見4.2.1.3

4.2.2.4    凍結保藏

將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。

4.2.2.5   保藏周期

一般1-5年。

4.2.2.6    復蘇方法

從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當快速搖動。直到內(nèi)部結冰全部溶解為止，約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

4.2.2.7   適用范圍

各類微生物。