液氮超低溫保存原理

　　超低溫——班德液氮罐冷凍保存的是液氮(一196℃)中使保存的活細(xì)胞物質(zhì)代謝和生長幾乎完全停止的保存方法。在這樣的冷凍條件下，調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞生長代謝的各種酶的作用受到極大抑制，細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)十分緩慢，甚至停止，避免了細(xì)胞遺傳性狀的改變和遺傳漂變。在最佳條件下活化后，細(xì)胞仍可保持其原有的代謝活性。

　　1.1 冷卻過程中細(xì)胞受損傷的兩因素假說

　　在低溫冷凍過程中，冰晶的形成、滲透壓、保護(hù)劑毒性給細(xì)胞造成多種脅迫并對細(xì)胞有一定的損害，此方面以Mazur[63建立的“雙因素假說”最為著名。冷凍損傷由兩個(gè)獨(dú)立的因素造成：一是溶液損傷，如果冷卻速度很慢，則細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露時(shí)間過長，為達(dá)到胞內(nèi)外溶液濃度平衡，水分由胞內(nèi)大量流出，細(xì)胞劇烈收縮，引起細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)和細(xì)胞器的變化;二是胞內(nèi)冰的形成，如果冷卻速率過快，則溶液中形成大量的冰晶，濃度急速升高，但因細(xì)胞膜的滲透率有限，胞內(nèi)溶液的水分子來不及滲出.造成過冷而結(jié)冰。

　　解凍速度過慢時(shí)，胞內(nèi)冰還會發(fā)生再結(jié)晶。在冷卻和解凍過程中形成的冰晶都可引起細(xì)胞體積變大或直接作用于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)而造成致命性機(jī)械損傷。因此為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的超低溫保存需在溶劑中加入一定種類的低溫保護(hù)劑，如甘油、脫脂乳、蔗糖、二甲基亞砜等，不但可以減少胞內(nèi)水含量，還有保護(hù)細(xì)胞中大分子物質(zhì)的作用。

　　1.2溶液玻璃化理論

　　玻璃化是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)的固化過程。它和常見的液體轉(zhuǎn)變?yōu)榫w或部分結(jié)晶的固體的凍結(jié)過程不同，玻璃態(tài)固體分子之間的關(guān)系和液態(tài)無明顯變化，而一般的晶體分子之間的關(guān)系和液態(tài)相差甚遠(yuǎn)。使溶液玻璃化的途徑有兩條：一條是增加溶液中保護(hù)劑濃度，當(dāng)降溫速度高于臨界冷卻速度時(shí)即可形成玻璃化，然而過高濃度的保護(hù)劑對細(xì)胞具有毒性作用;另一條是極大的提高冷卻速率，在冷卻過程中存在一個(gè)結(jié)晶高峰溫度范圍(240～200 K)被稱作“危險(xiǎn)溫度區(qū)”，超快速冷卻顯著縮短了通過“危險(xiǎn)溫度區(qū)”的時(shí)間，促進(jìn)玻璃化的形成。