-80℃及液氮凍存外周血干細(xì)胞的基礎(chǔ)及臨床研究 氣相液氮罐

摘要 目的：探討非程控降溫-80℃冰箱凍存自體外周血干細(xì)胞(APRSC)與程控降溫液lu凍存APBSC對細(xì)胞生物學(xué)的影響，井對自體造血干細(xì)胞移植的效果進行比較，為非程控降溫-80℃冰箱凍存APBSC在臨床上的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。方法：回顧性分析非程控降溫-80℃冰箱凍存APBSC及群控降溫液氮凍存APBSC對ANC、MNC、CD34+細(xì)胞以及CFU-GM回收率的影響，并對72例接受自體造血干細(xì)胞移植的血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人的造血重建的速度進行了比較。結(jié)果：兩種凍存方法的ANC、MNC、CD34+細(xì)胞及CFU。GM回收率的影響無顯著差異，移植后造血重建的速度亦無顯著差異。結(jié)論：非程控降溫-80℃冰箱凍存APBSC是一種簡便易行的凍存方法。在國內(nèi)某些單位可以替代程控降溫液氰凍存APRSC進行干細(xì)胞移植。

關(guān)鍵詞 自體造血干細(xì)胞移植 造血干細(xì)胞(凍存) 惡性腫瘤

非程控降溫-80℃冰箱凍存自體外周血千細(xì)胞(APBSC)因其簡便易行。在國內(nèi)上E在不斷地推廣，我科自1988年開展程控降溫液氨凍存APBSC進行干細(xì)胞移植及非程控降溫-80℃冰箱凍存自體外周血干細(xì)胞移植以來，共完成了72例。現(xiàn)將兩種凍存自體外周血干細(xì)胞移植結(jié)果總結(jié)如下。但禹內(nèi)尚缺乏對二者的系統(tǒng)比較研究。我們試圖通過系統(tǒng)比較二者的區(qū)別。觀察非程控降溫-80℃冰箱凍存APBSC進行干細(xì)胞移植的有效性和可行性。

病例和方法

1.1病例液氮涼存組36例，男性19例，女性L7例。平均年齡26。2(4—47)歲。急性髓細(xì)胞白血病(AWL)兒例，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)12例。非霍奇金淋巴瘤(NHL)6例，骨髓增生異常綜合征(iWI)S)RAEBT 3例，霍奇金淋巴瘤(1-11))l倒，粒淋混合急性白血病2例，多發(fā)性骨髓瘤(刪)l例。-80℃冰箱凍存組36例，男23例。女13例，平均年齡25。4(5—50)歲。急性髓細(xì)胞白血稍(A虬)7倒，急性淋巴細(xì)胞白血稿(從L)13例。非霍奇金淋巴瘤(NltL)11例。骨髓增生異常綜臺征(MDS)RAEBT l例。霍奇金淋巴瘤(1iD)2例。粒淋混合急性自血病l例。乳腺癌l例，神經(jīng)母細(xì)胞瘤l例。

1.2 APBSC動員[21 全部病例均采用化療+刺激因子進行動員。方法為強化化療后9。10大+WBC確已F降至zui低值(一般在2。0X10’，L以F)，并開始有回升的趨勢，同時PLT不低于20X109幾時，使用造血刺激園子，利罱為150p∥12b。皮F注射。至采集結(jié)求。動員天數(shù)，液氮凍存組，平均5犬(4—7犬)：一80℃冰箱凍存組，平均4。5天(3-6天)。

1.3 APBSC采集當(dāng)w13c恢復(fù)至4.0—10。0X 10 9／L時開始采集，液氮凍存組均用Bxter公司的CS一3000型血細(xì)胞分離機進行分離采集；-80℃冰箱凍存組均用COBE公司的Spectra型血細(xì)胞分離機進行分離采集。通過股靜脈插管(12F般腔Arrow公司)或通過救臂外周靜脈建立外周通道。每次循環(huán)血量中位數(shù)為8000ml(5000—13000m1)。采集時分血流速平均50m1／分。兩組采集的有核細(xì)胞數(shù)(Nc)、單個核細(xì)胞數(shù)(M№)、CD。CFU。GM的數(shù)量見表。。臺盼藍(lán)拒染率均為100％。

I.4 APBSC凍存兩組采集的APBSC懸液，平均每次約60m1。加少許肝素。計算單個核細(xì)胞(眥)數(shù)，加入R蹦r1640保養(yǎng)液，按l：1比例與冷凍保護液均勻混合。-80℃冰箱凍存組使保護液終濃度為5％二甲基強砜(刪S0)，6％羥乙基淀粉(HES)，螂白蛋白(ALB)，llNC含量為2—5x 10 8／ml。將所得混合液裝于冷凍袋中。直接置于-80X]冰箱中凍存。液lu組保護液終濃度為5％1圳S0，經(jīng)卜3℃／分程控降溫至-80℃后置-196℃液氮中保存。凍存大數(shù)，液氮凍存組，中付數(shù)22.5(13—50)天。-80℃冰箱凍存組，中位數(shù)23(15-44)天。

1.5預(yù)處理方案兩組病人的預(yù)處理方案相似，即AML、ALL、MDS及NHL均用CAT或CET.C：CTX 60mg／kg／d×2天，A：Ara—c卜39／d×l天.E：vPl6 300-1000 mg／d×l天，中位劑量600mg／d.TBI總量zui低6Gy，zui高8.5(毗分兩天，劑量率<5.0rad／min。預(yù)處理結(jié)束后24小時回輸APBSC。

l.6 APBSC的解凍：將凍存袋自-80℃冰箱中或液氮中取出后立即放入40℃水浴箱中訊速解凍，不過濾，經(jīng)中心靜脈插管訊速回輸。

結(jié)果

2.1 凍存前后APBSC的細(xì)胞數(shù)及回收率見表1。

2.2移植后造血功能重建見表2~表3。

2.3生存期及復(fù)發(fā)率液氮凍存組無病生存期40個月，復(fù)發(fā)率30。8％(1l例)。-80℃凍存組無病生存期39個月，復(fù)發(fā)率28％(10例)。移植后隨訪液氮凍存組共死亡ll例。-80℃凍存組共死亡6例。

討論

APBSCT采集后不能立即回輸。需凍存至少l周時間，或更長時間。凍存的目的是停止細(xì)胞代謝保持細(xì)胞活力，液氮(-196℃)溫度低，酶活性被完全阻斷，但由于這種方法設(shè)備昂貴、程序復(fù)雜而難于普及。1985年SZill等口l＼”1報道用6％細(xì)胞外冷凍防護劑羥乙基淀粉(1iES)和5％二甲基亞砜(DMS0)作為PBSC的冷凍訪護劑，不經(jīng)程控降溫直接在-80"C冰箱中保存的方法，兩種凍存方法的NC、MNC、CD34、CFU—GM的回收率相擬I¨l，移植后造血重建(自細(xì)胞及血小板的恢復(fù))時間也無差異t“1，本研究從來自兩個組的凍存結(jié)果來看與其所報道結(jié)果一致。但由于。80℃冰箱的凍存方法開展時問短，尚缺乏大樣本病例對比研究。我們試圖通過大樣本病例的對比研究，以期能得到更為全面準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，為今后普及。80℃冰箱凍存APBSC進行移植治療惡性腫瘤病人而提供更可靠的依據(jù)。研究結(jié)果顯示二者所凍存細(xì)胞的Nc、刖c、CD34+細(xì)胞、CFU-GM的回收率及移植后造血功能重建均無顯著差異。移植后隨訪液氮凍存組共死亡15例，一80℃凍存組共死亡12例，均為復(fù)發(fā)后死亡。液氮凍存組無病生存期及復(fù)發(fā)率與一80"C凍存組無病生存期及復(fù)發(fā)率相仿。

1962年Goodman等實驗證實鼠、狗、猿等哺乳動物和人的外周血循環(huán)中存在造血干細(xì)胞。但在正常生理條件下。數(shù)量極少，正常人和疾病穩(wěn)定期患者外周血中CD34+細(xì)胞數(shù)量為0。1-0。2％，只有骨髓中CD34+細(xì)胞數(shù)量的1-10*／d41，不能滿足臨床移植的需要。

經(jīng)化療藥物和戚造血刺激因子可從骨髓中動員出大量造血干細(xì)胞唧，目前常用的化療藥物有環(huán)磷酰胺(CY)、足葉乙甙(VPl6)、順鉑等可增加血液中CFU。GM產(chǎn)量的6,5—13。3倍。細(xì)胞生長因子如G-CSF、GM。CSF等可增加外周血中CFU。GM達(dá)4-8倍。而化療藥和細(xì)胞生長因子聯(lián)臺應(yīng)用效果更佳№’”，且動員的CD34+細(xì)胞具有更高分化潛能。本研究中，AML及MDS多用HAE方案，ALL多用MOEP方案，粒淋混合AL多用MOEP或HAE方案，NHL、HD多用MOEP或單用大劑量CTX(4。0)作為動員化療方案。既能起動員作用，又能起鞏固治療作用。

干細(xì)胞采集時間和采集量是移植能否成功的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)動員化療后，患者平均第6_7天WBC降至雖低，給予G-CSF 300 u g／d后患者外周血MNC迅速回升。楊勃彥等曾分別測定給G-CSF后MNC和CD34+、1by。1+細(xì)胞的變化，經(jīng)統(tǒng)計平均注射G.CSF后第6-8天外周血CD34+細(xì)胞峰值，為采集zui佳時間。個別患者MNC上升過快或過緩，則需測定CD34+細(xì)胞以協(xié)助決定干細(xì)胞采集時間。干細(xì)胞采集量個體差異較大，采集范圍MNC為(2.3—7.55)×105，kg，CD34+細(xì)胞為(2.22。9.56)×106／kg，平均6。34×106／kg，經(jīng)凍存，回輸時活細(xì)胞百分率平均>65％。非程控降溫-80"C冰箱保存APBSC的方法可靠、簡便，為APBSET的推廣應(yīng)用創(chuàng)造了便利條件。